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    公开号:WO1989002458A1
    申请号:PCT/JP1988/000890
    申请日:1988-09-05
    公开日:1989-03-23
    发明作者:Masahiko Ishida；Yuusaku Nishimura；Tetsuo Yamaguchi；Kazuyuki Itoh；Harumi Matsuzaki；Kenji Baba；Setsuo Saitou；Hayao Yahagi；Masayoshi Kubota；Ryoichi Haga
    申请人:Hitachi, Ltd.；
    IPC主号:C12N1-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 細胞培養方法及び装置
    [0003] 〔技術分野〕
    [0004] 本発明は、 生物細胞の培養方法に係 り 、 特に、 生物細 胞を液体培地中で通気培養し、 副生物質の除去を効率良 く行なう 、 大規模かつ高濃度な細胞培養方法並びに装置 に関する。
    [0005] 〔背景技術〕
    [0006] 最近、 従来の微生物細胞すなわち菌体の培養に加え、 動物細胞の培養によ リ イ ン タ ー フ ェ ロ ン等の医薬品の生 産が行われはじめた。
    [0007] こ う した医薬品を工業的に生産するためには大規模か つ高濃度で長期間安定した培養法が必要となる。 このた め、
    [0008] ①生物細胞と培養液と を分離し、 新鮮な培養液を供給す る技術、
    [0009] ②生物細胞の生育に必要な酸素を供給する技術、
    [0010] を具備した細胞培養方法の開発が望まれている
    [0011] 上記①の要件を達成するには、 培養液中に浮遊してい る細胞を無菌的に分離濃縮する必要がある。 培養液を交 換せずに細胞を培養した場合、 多く の細脸系においては、 2 X 1 0 6 個 " ιη β 前後の細胞濃度が最大値である。 こ れに対し、 培養液中の細胞を分離濃縮し、 新鮮培養液で 培養を継続した場合には 1 0 7 個/ πι 以上に細胞濃度 を上げる こ と ができ、 培養槽の小型化及び培養時間の短 縮を図る ことができる。
    [0012] 細胞の分離濃縮に対しては、 少量試験用には一般に遠 心分離法が用い られるが、 大規模にこれを無菌的に行な う こ とは、 培養液の交換に要する時間とプロセスの複維 さ から困難である。 そこで、 培養槽内への新鮮培養液の 供給と細胞が副生する老廃物の除去を、 細胞の分離濃縮 操作と時間をおかずに行う方法が提案されている。 例え ば特公昭 55 - 1 6635 号及び特開昭 6 2 - 265 号記載の方法 は、 培養槽内に細胞の沈降ゾーンを設け、 沈降ゾーンの 上澄液を排出しながら新鮮培養液を供給する。 また、 特 開昭 61— 2571 8 1号， 特公昭 62— 1 2989 号および特公昭 6 2 - 1 2990 号記載の方法は、 培養槽内に培養液は透過する が細胞は透過しない壁膜を有する中空糸膜を設け、 これ を介して新鮮培養液の供給と副生物質の除去を行う 。
    [0013] また'前記②の酸素供給技術については、 従来、 微生物 等の培養においては培養液中に直接空気も し く は酸素富 化空気を通気する手段がと られてきた。 しかし、 これら の細胞を培養する際に用いる液体培地又は細胞を含む培 養液は発泡性のものが多い。 特に血清を添加して行う動 物細胞の培養の場合には、 血清中に含まれる生体高分子 類及び培養中に分泌される生体高分子類に起因する培養 液の発泡が著 しい。 これは放置 した り 、 機械的に剪断力 を与えても破泡 し に く く 、 泡が培養槽気柑部を満た し、 やがて系外に溢流 して し ま う 。
    [0014] これ らの発泡性の培養液では、 液中に酸素を供給する 方式と して、 気泡を立てずに液中に酸素を溶解させる 力、、 液中通気によ リ発生する気泡を消泡する必要があ る。
    [0015] 従来は前者の方法が主と して指向さ れて きた。 具体的 には、 培養槽気相部に通気し、 液面から酸素を溶解させ る方法であ り 、 通常、 酸素と の接触を良 く する ため液を 撹拌した り 、 通気量を多 く して液面と の接触を増加させ ている 。
    [0016] 上記については、 特開昭 61— 74574 号公報， 特閧昭 61 - 36915 号公報， 特開昭 60— 2591 79号公報に記載されて いる。
    [0017] 従来の細胞を培養液よ り分離濃縮する技術の う ち、 細 胞を沈殿させて分離濃縮を行う方法では、 細胞の沈降速 度が遅いため必然的に培養槽内に占め る沈殿糟の容積を 大き く しなければな らなかった。 振動や温度差によ り培 養液が対流を起こす と、 上澄液に細胞が混入 し分離効率 が低下する と云う 問題がある。
    [0018] また中空糸膜やフ ィルタ によ り細胞の分離濃縮を行う 方法では、 膜やフ ィルタ 上への細胞の付着を完全には防 止できないため に、 培養中に膜や フ ィ ルタ が目 づま り を 起こす。 この状態で強制的に加圧し分離濃縮を行う と、 細胞が損傷する等の問題がある。
    [0019] 一方、 液面通気方式による酸素供給法は、 液の撹拌を 強くする と細胞が破碎されるため、 動物細胞でば実質的 に 5 0 r p m 以下に限定される し、 通気量も 1 c m / s ec が 上限である。 上記の通気量を保持するには培養設備に大 容積の無菌空気調整設備が必要であ り、 また、 長期の培 養においてはガスに伴って散逸する培養液の損失も大き い
    [0020] 他方、 液中通気方式による酸素供給法は、 効果的な消 泡技術 ない。 細胞壁が強固でかつ増殖速度の大きい一' 部の微生物を対象と した培養法において、 気泡を高速回 転翼で機械的に破壌する方式が提案 （特開昭 54— 1 3464 号公報， 特公昭 56— 12108 号公報） されているにすぎな い。 この方法は、 槽内に高速駆動部を設けなければなら ないため、 構造が複雑となる。 動物細胞はこのような剪 断力には極めて弱いため、 この方法は適用できない - 〔発明の開示〕
    [0021] 本発明の第 1 の 目的は、 細胞の損傷やフィルタ の 目詰 リ を防止し、 かつ細胞の分離濃縮と培養液の交換を無菌 的に効率良く行う細胞培養方法並びに装置を提供する に ある。
    [0022] 本癸明の第 2 の 目的は、 細胞を分離した培養液中に溶 解 している老廃成分を除去 し、 これを再び細胞の培養に 供する高濃度の細胞培養方法並びに装置を提供する にあ る 。
    [0023] 本発明の他の 目的は、 細胞の増殖に害する こ と な く 、 培養液の消泡を行う細胞培養方法並びに装置を提供する にある 。
    [0024] 上記目 的は下記によって達成する こ と ができ る。
    [0025] ( 1 ) 生物の細胞を液体培養しながら培養液の一部を濾過 膜を用 いて濾過 して取 り 出 し、 新 し い培養液を補給す る細胞培養方法において、 上記濾過膜が疎水性濾過膜 であ り 、 該滤過膜は間欠的に培養.液で逆洗する こ と を 特徵とする細胞培養方法。
    [0026] ( 2 ) 生物の細胞を液体培養しながら培養液の一部を濾過 膜を用いて濾過 して取 り 出 し、 新し い培養液を補給す る細胞培養方法において、 上記濾過膜が疎水性濾過膜 の表面に親水性濾過助材層を有するプ レ コ一ト膜であ リ 、 該濾過膜は間欠的に培養液で逆洗する こ と を特徵 とする細胞培養方法。
    [0027] ( 3 ) 前項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜が 1 本以上 の中空糸膜である こ と を特徴とする細胞培養方法。
    [0028] ( 4 ) 前項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜が培養液の 液滴と の接触角が 8 0度以上の素材で形成さ れてい る こ と を特徴とする細胞培養方法。 (5) 前項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜の濾過孔を 培養液で充墣してから濾過を行う こ とを特徴とする細 胞培養方法。
    [0029] (6) 前項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜の限界圧以 上で逆法するこ と を特徴とする細胞培養方法。
    [0030] (7) 前項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜を逆洗する 培養液が、 濾過した培養液から老廃成分を除去した培 養液であるこ と を特徴とする細胞培養方法。
    [0031] (δ ) 前項 1 または 2 において、 濾過した培養液中の老廃 成分を老廃成分除去手段によ り除去し、 該老廃成分除 去液を疎水性濾過膜の逆铣用液の一部または全部と し て用いる こ と を特徵とする細胞培養方法。
    [0032] ( 9 ) 前項 8 において、 老廃成分除去手段が拔散透析法、 限并瀘過法または精密濾過法であること を特徵とする 細胞培養方法。
    [0033] ( 10)前項 1 または 2 において、 培養液中に撹拌翼を設け、 該撹拌鬂の回転面の周囲に疎水性濾過膜を設けたこと を特徵とする細胞培養方法。
    [0034] ( 11 )前項 1 または 2 において、 培養によ り生成する培養 液の泡沫を、 培養液面上に配置した撥水性消泡層と接 蝕させることによ り、 該泡沬を破泡しながら培養を行 う こと を特徵とする細胞培養方法。
    [0035] (12)前項 1 1 において、 該消泡層の表面が、 培養液'の液 滴と の接触角が 3 0度以上の撥水性を有する こ と を特 徴とする細胞培養方法。
    [0036] (13)前項 1 1 において、 少な く と も消泡層表面に形成さ れた撥水性材料が有機けい素高分子であ る こ と を特徴 とする細胞培養方法。
    [0037] (14)前項 1 1 において、 消泡層が多孔性であ り 、 その開 口比が 5 0 %以上であ る こ と を特徴とする細胞培養方 法。 '
    [0038] (15)前項 1 1 において、 消泡層が多孔性であ り 、 その孔 の大き さ が 2 〜 5 O mmであ る こ と を特徴とする細胞培 養方法。
    [0039] (16)前項 1 0 において、 消泡層が、 粘度が 1 X 1 04 セ ンチポィ ズ以上の撥水剤を基材に塗布ま たは含浸さ れ たも のである こ と を特徴とする細胞培養方法。
    [0040] (17)前項 2 において、 親水性瀘過助材が細胞の沈降速度 よ リ大なる沈降速度を有する こ と を特徴とする細胞培 養方法。
    [0041] (18)前項 2において、 濾過膜を収納する瀘過器を培養槽 と配管で連結して培養槽の外部に設け、 疎水性濾過膜 を瀘過器内の上部に配置し、 密 '度が培養液の密度よ り も小さ い親水性瀘過助材を用い る こ と を特徴とする細 胞培養方法。
    [0042] (19)培養細胞に対する有用ガスの供給手段、 培養液の供 給手段、 老廃培養液の排出手段を有する生物細胞の液 体培.養装置において、 上記老廃培養液の排出手段が疎 水性濾過膜からなる培養液濾過手段を介して設けられ、 かつ、 該疎水性濾過膜が培養液によ リ逆铣できる手段 を有する生物細胞の液体培養装置。
    [0043] ( 20 )培養細胞に対する有用ガスの供給手段、 培養液の供 給手段、 老廃培養液の排出手段を有する生物細胞の液 体培養装置において、 上記老廃培養液の排出手段が疎 水性瀘過膜から培養液瀘過手段を介して設けられ、 該 琼水性濾過膜が培養液によ り逆洗できる丰段を備え、 かつ、 培養液表面上に消泡手段を有する生物細胞の液 体培養装.置。
    [0044] ( 21)前項 1 9 または 2 0 において、 培養液濾過手段が疎 水性中空糸膜の表面に親水性濾過助材層を有するプレ コ一 卜膜から成る こと を特徵とする生物細胞の液体培
    [0045] ( 22 )疎水性中空糸膜 C 雨端に、 外径が中空糸膜の内径よ リ大で、 その先端部において中空糸膜に揷入可能な外 径を有するよ う に勾配を持たせて成形され、 かつ、 該 中空糸膜の離脱防止のための突起部分が設けられた膜 拡張部材が揷入されており、 該揷入都が接銃部に固定 され、 該接続部を介して配管と連結し得るよう にした ことを特徵とする生物細胞分離用濾過器。 本発明の細胞培養方法は、 生物細胞の増殖培養に用い られ、 培養容器， 細胞と培養液と を分離する手段， 老廃 成分を除去する手段， 老廃成分を除去 した培養液を培養 容器に戻す手段、 及びこれ ら を接続する配管類から構成 されている。
    [0046] 培養容器すなわち培養槽では生物の細胞が培養液中に 浮遊している。 培養液中には無機塩， グルコース， ア ミ ノ酸， 抗生物質等が添加されてお り 、 また、 必要に応 じ て血清が加え られてい る。
    [0047] 本発明の培養方法に用い られてい る培養槽の特徵は、 培養液を収齊する容器， 培養液を撹拌する手段， 細胞と 培養液と を分離する手段， 該容器の底部近傍から培養に 必要な気体を該培養液に供給する手段， 該培養液の液面 の上方に位置 し、 気体を通過 し う る多数の開口 を有する 撥水性消泡手段、 及び培養の進行度を検出する手段を有 する通気培養槽にある。
    [0048] 本発明において、 細胞と培養液と を分離する手段と し ては、 疎水性濾過膜を用いる。 特に琼水性中空糸膜が好 ま しい。 疎水性濾過膜は、 培養液滴と の接触角が 8 0度 以上、 好ま し く は 9 5度以上の素材で構成さ れたもので ある こ と が望ま しい。 その開口度は、 生物細胞が実質的 に透過せず、 かつ所要量の培養液を透過させる ため には、 5 μ π！〜 0 . 5 μ πιのものが好ま し い。 次に、 培養液中に気体を通じる と気泡が発生するが、 培養液面上に撥水性材料によ リ搆成された多孔性の消泡 手段を設けることによ り、 該気泡を破砕することができ る。 該消泡手段の撥水性材料は， 培養液の液滴との接触 角が 3 0度以上のものであるこ とが望ま しい かかる、 撥水性材料と しては、 例えば有機けい素高分子材料が好 ま しい。 上記消泡手段は、 その少な く とも表面層が上記 の撥水性材料によって構成される。
    [0049] 〔図面の箇単な説明〕
    [0050] 第 1 図〜第 7 図および第 1 4図は、 本発明の一実施例 の概要を示す構成図、 第 8図 Aは膜支持部材の斜視図、 第 8 図 B は、 第 8 図 Aの膜支持部材に中空糸膜を装着し た濾過ユニッ トの斜視図、 第 9 図は膜支持部材を示す平 面図、 及び断面図、 第 1 0 図〜第 1 3図ば、 濾過ュニッ 卜の形状を示す斜視図、 第 1 5 図は中空糸膜の瀘過圧と 濾過流量との関係を示す曲線図、 第 I S図〜第 2 0 図は 本発明による細胞培養日数と細胞濃度との関係を示す曲 線図、 第 2 1 図〜第 2 8 図は、 消泡層の斜視図である。
    [0051] 〔発明を実施するための最良の形態〕
    [0052] 第 1 5図は、 親水性膜と疎水性膜の透過特性を示す。 図中、 破線が親水性膜、 実線が疎水性膜を用いた場合で ある。
    [0053] 親水性膜の透過特性は、 濾過圧に比例する - これに対 ' (ID し疎水性膜は、 その細孔内にガスが存在する場合、 すな わち運転前においては、 限界圧 （疎水性の程度， 細孔径 膜厚， 膜内空隙率等に依存する） 以下の濾過圧では、 液 は透過せず、 限界圧と なって初めて液が透過する。 一度 液が透過する と、 すなわち膜の細孔内が液で満たさ れる と その透過特性は、 瀘過圧によ らず親水性膜と 同等と な る。 図中実線の矢印のよ う に変化する。
    [0054] 細孔径 0 . 0 i m のポ リ テ ト ラ フルォ ロ エチ レ ン製ホ 口 一ファイ ノ （外径 2 mm, 内径 1 mm)の限界圧は、 1 . 5 kg/cm2 であ り 、 液充満後の透過特性は、 ほぼ 1 0 0 m β / mraHg · m 2· h r である。 この透過量は親水性膜の 透過量にほぼ一致する。
    [0055] 従って、 上記ホ ロ一ファイバを用いて、 濾過または逆 洗する場合は、 それが最初の使用の と きは、 上記限界圧 以上で一旦操作し、 膜細孔内に液を充満する こ と が必要 である。
    [0056] 疎水性中空糸膜と しては、 特に限定するも のではない が、 1 3 0 °C程度での雰囲気でも十分な強度を保ち、 濾 過のための小孔径が変化しないよ う な疎水性材料か ら成 るもの を用いる必要がある。 特にテ ト ラ フルォ πェチ レ ン樹脂製のものは、 こ う した点で好ま し い。
    [0057] 疎水性濾過膜は長い 1 本の中空糸膜を用 いても よいが、 膜表面の有効利用 を図る ためには複数本を束ねた状態で 用いるのが望ま しい。
    [0058] 特に溶接や接着による接続がむずかしいテ ト ラ フルォ 口エチレン樹脂製の中空糸膜を用いる場合には、 下記の よう な接続方法によ り良好な膜ユニッ ト を得る ことがで さる。
    [0059] 第 9 図に示すよ う に、 中空糸膜 1 0 の雨端に膜拡張部 材 5 2 を揷入する。 膜拡張部材 5 2 は、 中空糸膜 1 0 の 内径よ リ大なる外径を有する中空の管状をなしておリ、 その先端は、 中空糸膜 1 0内への挿入を容易にするため に先端に行く ほど靳面積が徐々 に小さ く なる形状を有し、 かつ表面の一都に局所的に外径の大なる突起部を有して いる。 膜拡張部材 5 2 を揷入した中空糸膜の末端を、 室 温硬化性の樹脂ワニスで包含したのち、 これを硬化させ る。 必要に応じて外形を成形して膜接続部材 5 1 と し、 濾過用配管への接続端とする。 複数の中空糸膜 1 0末端 を束ねて同一の膜接続部材 5 1 に敢付ければ、 複数の膜 から成る濾過ユニッ トを作製できる。 なお、 中空糸膜濾 過ュニッ トの一例を第 8図及び第 1 0 図〜第 1 3 図に示 す。
    [0060] 疎水性を有する膜を用いる こ と によ り 、 膜面への細胞 や汚れの付着を大幅に軽減でき、 長期間の濾過に使用が 可能となる。 - 所定量の培養液を抜き出した後に疎水性濾過膜に新鮮 な培養液を逆に圧入する こ と によ り 、 濾過膜面上に付着 した細胞や汚れを遊離させる。 逆洗用液と しては、 未使 用の新鮮培養液または使用済の培養液から老廃成分を除 去 した液あ るいはこれ ら の混合液でも よい。
    [0061] 疎水性濾過膜 1 0 を培養槽 2 内の培養液中に設ける場 合 （第 5 図） 培養槽 2 内に滞留部分が生 じて、 細胞の沈 積を起すこ と のないよ う に培養液 1 の 円滑な流動を維持 でき、 かつ細胞に不要な剪断力 を与えないよ う な形状及 び設置位置を考虑する必要がある 。 なお、 この場合の培 養液の抜き出 しは、 でき るだけ低流量で行な う こ と が望 ま しい。
    [0062] 疎水性濾過膜 1 0 を培養槽 2 の外に設ける場合 （第 2 図） は、 濾過器 8 内に収容さ れる 。 該濾過器 8 は配管等 によ り培養槽 2 に接続さ れる。 なお、 このよ う な疎水性 濾過膜 1 0 を培養槽 2外に設けた場合には、 培養液の抜 き出 し速度はでき るだけ高流量で行い、 所定の液量に達 した時点ですみやかに細.胞を培養槽 2 に戻すよ う な運耘 操作が必要と なる。
    [0063] 疎水性濾過膜 1 0 が培養槽 2外に設けた濾過器 8 内に 収容されている場合には、 該膜は、 その表面に親水性濾 過助材を有する プリ コー ト膜であ る こ と が望ま しい。 こ の場合、 瀘過器 8 内には、 底部ある いは底部と上部の両 方に、 疎水性瀘過膜 1 0近傍に瀘過助材 9 を保持するた めの フィルタ 1 1 を設ける。
    [0064] ここでフィルタ 1 1 は有機高分子材料， ガラス， セラ ミ ック ， 焼結金属等の多孔質の材料で構成されるが、 そ のと きの開孔度は濾過助材 9 の粒子が実質的に透過しな いよう に選定される。
    [0065] 培養槽 2 から培養液を瀘過器 8 に導入する と、 培養液 内の細胞は濾過助材 9 の粒子によ り捕捉される = 瀘過助 材 9 は、 細胞に対し毒性がない有機高分子， 無機化合物 を 1種以上混合したものであ り、 細胞との付着性， 鈿飽 の粒径等に応じて材質， 粒径， 形状、 および充塡量を選 定する。
    [0066] 例えば、 粒径 5 〜 5 0 mの細胞に対しては、 濾過助 材 9 の粒子間のいおゆる "さえぎり効果" だけで細胞を 捕捉する場合にはろ過助材粒子径は細胞の粒径と同程度 とする。 これに対し、 細胞が濾過助材 9 に対して付着性 を示す場合には濾過助豺 9 と して数 1 0〜数 1 0 0 πι 程度の粒径の'ものを用いるのがよい。 マイク ロキャリア ビーズを用いれば付着性培養が可能である。 多く の細胞 に対しては、 上記の雨方の効果を考慮した濾過助材 9 が 選定され、 その充填量は濾過助材 9で培養液中.の細胞の 大部分が捕捉されるよ う に選定する。 したがって、 濾過 器 3 内に導入された培養液が濾過助材 9 を通過し、 疎水 性濾過膜 1 0 に到達した時には、 培養液中に細胞は殆ど 含まれておらず、 長期間の運転であっても実質的に疎水 性濾過膜 1 0 の 目づま り が防止できる。
    [0067] 濾過器 8への培養液の通液流量は、 濾過器 8 の代表内 径に基づく単位表面積当 り 0 . 1 〜 ： L 0 m 3 Z m 2 ' h程 度にする と濾過助材 9 の粒子間を培養液が通過する際の 剪断力による細胞の損傷を防止できる。 ただし、 この値 は、 細胞の種類、 濾過助材 9 の粒径、 瀘過器 8 の構造等 によって異なる。
    [0068] 疎水性瀘過膜 1 0 は培養液中の副生物質を透過でき る から、 上記によ り、 培養液中の細胞を分離濃縮し、 老廃 物等の副生物質の排出が達成される。
    [0069] 所要量の培養液を培養槽から排出 した後は、 濾過器 8 に新鮮培養液を導入する。 こ こで新鮮培養液とは、 未使 用の培養液であっても、 また使用済みの培養液中の細胞 の副生物質を除去処理したものでも良い。 また、 培養液 の組成も、 培養槽内と異なっていても良い。 こ う した新 鮮培養液を瀘過器 8 に逆に導入する と、 これによ り濾過 助材 9 の粒子が上昇 （又は下降） し前記工程で捕捉され た細胞と ともに展開する。
    [0070] 前記の濾過助材 9 に要求される材質， 粒径， 形状等は .， 上記の工程を効率良く 行う ために細胞よ リ も速く沈降す る粒子 （又は培養液中に浮上する粒子） でなければな ら ない。 細胞よ り も速く 沈降する粒子群を濾過助材 9 と し て用いた場合、 濾過器 8への新鮮培養液への流量は、 —展 開させる対象の濾過助材 9 のうち最も沈降速度の速い粒 子群がわずかに浮き上がる程度にすること が望ま しい。 この時、 展開させる対象の瀘過助材 9 は実質的に全て展 開するので、 細胞は瀘過助材 9 と分離し、 少な く とも細 胞よ り も沈降速度の速い粒子群の上部にまで浮遊する。 濾過助枋 9 を通過した新鮮培養液が培養槽 2 に移送でき るよう に配管されているから、 濾過器 8上部に浮遊した 細胞は新鮮培養液とともに培養槽 2 に戻される。
    [0071] ここで、 濾過助材 9 の中に細胞の粒径よ りも大きい粒 子群が含まれる時には、 細胞は透過されるが該粒子群は 透過できない程度の開孔度を有するスク リーン等を濾過 器 8上部に設置する と、 濾過助材 9 の培養槽 2への浮上 混入が防止できる。 さ らに、 新鮮培養液によって疎水性 濾過膜 1 0 が逆铣されるのでよ り膜の使用寿命を延ばす こ と ができる。
    [0072] また、 培養液中に浮上する粒子群を濾過助材 9 と して 用いる第 2 図のよう な場合には、 濾過器 8への新鮮培養 液の通液量は、 展開させる対象の濾過助材 9 のう ち最も 浮上速度の大きな粒子群が下降し、 濾過助材層が流動拔 態を示す程度にすることが望ま しい。 この結杲、 細胞は 濾過助材 9 と分離して沈降し、 瀘過器 8 と培養槽 2 を違 結した配管内を逆洗用液と ともに搬送されて培養槽 2 に 戾される。 こ こで、 濾過器 8 底部には、 細胞を透過 し、 濾過助材 9 を透過 しない開孔度を有する フィルタ 1 1 を 設置してお く こ と が好ま しい。
    [0073] この工程によ る 1 回の操作での新鮮培養液の導入量は、 特に限定されないが、 前記培養液の排出工程における培 養液の排出量と 同程度である こ と が望ま し く 、 更に、 濾過助材 .9 に捕捉されて細胞の大部分が新鮮培養液と と も に培養槽 2 に戻されるだけの流量が望ま しい。
    [0074] 新鮮培養液の通液を停止する と展開 していた濾過助材 9 の粒子群はフィルタ 1 0 の上部あるいは周囲 に沈降す る が、 細胞の沈降速度よ り も速 く 沈降する粒子群が含ま れているため、 新鮮培養液中に培養槽に移送し きれなか つた細胞が淳遊していても、 この細胞がフィルタ 1 0 に 達する量はす く ない。
    [0075] 撥水性消泡手段は、 生物細胞を含有する液体培地中に 通気する際に液面上に発生する泡の消泡を 目 的とするも ので、 気体を逋過し う る多数の開口 を有し、 培養槽内の 培養液の液面の上方に設ける。 その開口比は 5 0 %以上 である こ と が望ま し く 、 開口径は 5 0 〜 2 mmである こ と が望ま しい。 さ ら に、 消泡手段は少な く と も表面層が撥 水性の材料によ リ形成する。
    [0076] 特に発泡性の著 し い血清添加培地を用 いる動物細胞の 培養に際 しても消泡効果が大きいので、 液中通気法によ る高効率酸素供給が可能となった。
    [0077] 撥水材と しては、 培養液の液滴が該撥水材の表面との 接触角 3 0度以上を形成する撥水性材料で、 かつ実質的 に培養液に不溶又は非分散性で、 かつ対象とする細胞に 実質上毒性を示さない材料であればよい。 消泡層はそれ 自体、 上記の撥水材で構成しても、 被覆， 塗布又は含浸 させたものでも良い。
    [0078] 例えば、 炭素数 1 0以上のシラン又はシロ キサンがあ げられる。 特に 1 X 1 0 4 センチポィズ以上の粘度を有 するものが適している。
    [0079] 1 X 1 0 センチボイズよ り低粘度の撥水材では、 培 養液面が撥水材で覆おれたり、 液中にェマルジヨ ン とな つて細胞に付着して增殖を阻害した りする。 また、 培養 後に培養液中から生産物の分離を困難にする。
    [0080] ポリ シロキサンの炭素数の上限及び粘度は特に限定さ れないが、 実質的に固体となる炭素数が 1 X 1 0 個、 粘度では 1 X 1 0 7 センチボイズが上限となる。
    [0081] 消泡層の開口比が 5 0 %未満である と、 液面上の泡が 破泡した際、 気体が円滑に消泡層を通過できず、 2次泡 が発生しやすい、 消泡層の開口部の径は好ま し くは 2 〜 5 0 mmである。 5 0 mmを越える と、 気泡が細かい場合、 消泡層との接触が不完全とな リ消泡されにく い。 一方、 2 mm未満になる と、 開口部の気体及び液の出入に円滑性 を欠 く 。
    [0082] 消泡層の構造は、 単層でも、 積層 したも のでも よ い。 さ ら に、 これ らは一体化されていても縦方向， 撗方向に 分割可能であっても よい。 層構造は液性， 通気量， 気泡 径によ り適宜選定する。
    [0083] 培養槽 2 内への通気は通常培養槽底部に ノ ズル 4 を配 置して行う が、 液面下な ら適宜配置 しても よ い。 また、 " 底部と液面の間に設けても よ い。 特に、 ド ラ フ トチュー ブ 3 が設け られている場合には ドラ フ トチューブ 3 の下 に ノ ズル 4 を配置する と培養液の下降流によ り気泡を よ リ長時間液中に滞流させる こ と ができ るので酸素の利用 率を向上させる こ と ができ る。
    [0084] 本発明において、 培養液と しては、 液の表面張力 が 4 5 〜 9 0 d y n Z cm 2がよい。 効果の大き い培養液と して は、 血清等の生体高分子を含有する培養液があげられる。 血清以外にアルブミ ンの様な蛋白質や、 核酸を添加又は 含有する培養液も極めて有効である。 外部から添加する 成分だけでな く 、 培養中に分泌される発泡性成分を含む 培養液も対象と なる。
    [0085] 老廃成分と しては、 疎水性膜を用いた培養瀘液に含ま れる乳酸， ア ンモニア等がある。
    [0086] 老廃成分を除去する手段と しては、 特に限定さ れない が、 拡散透析装置， 限外濾過装置， 電気透析装置等の公 知方法によ り行なう こと ができる。
    [0087] しかし、 培養濾液中には、 血清由来の沈殿物や細胞片 等の微細な固形物が多量に含まれている こ とから、 目詰 りの起り に く い形状を有する ことが望ま しい。 老廃成分 中の特に乳酸及びアンモニアは、 細胞の増殖を阻害する。 このため、 老廃成分の除去は、 上記のアンモニア， 乳酸 を指標と して行なう のがよい。 また培養濾液中には各種 のホルモン， 蛋白質等の細胞の生育に必要な成分も多量 に含まれており、 これらの成分はできるだけ回収して再 利用する ことが望まれる。 これらのこと から、 拡散透析 膜や限外濾過膜と しては、 分画分子量が 1 , 0 0 0 〜
    [0088] 1 0 , 0 0 0 程度のものを用いる こ と が望ま しい。 分画 分子量 1 , 0 0 0 未満の膜では透過量が小さ く 、 膜面積 を大き く しなければならないほ力、、 膜の 目詰リ が著しい ので、 長期間の使用に耐えない恐れがある。 一方、 分画 分子量 1 0， 0 0 0 を越える膜ではホルモン等の細胞の 増殖に有益な物質をも透過して しまう のでこれらの物質 の回収率が低下する。
    [0089] なお、 分子量の大きい蛋白抗体等の有用物質の分離に は、 0 . 0 1 m 程度の細孔柽を有する精密濾過膜を用 いるのがよい。 また、 これら を組合せて有用称質の分離 を多段に行う こ-とがよ り有利である。
    [0090] 拡散透析装置によ り老廃成分を除去する場合には、 透 析用液と しては、 新鮮培養液に含まれる各種の液， 各種 のア ミ ノ酸， ビタ ミ ン等の低分子成分と 同 じ濃度， 組成 の溶液を用いる こ と が望ま し い。
    [0091] 老廃成分除去後の液は、 前記の濾過器の逆洗液と して 用い培養槽内に戾され、 細胞の培養に有効利用 される。
    [0092] 本発明に適用でき る生物細胞と しては、 特に限定され る ものではな く 、 動物細胞， 微生物細胞， 植物細胞が含 まれる 。 動物細胞と しては、 例えば脊椎動物の各種細胞， 無脊椎動物の各種細胞， 原生動物の各種細胞があげられ る。 細胞は単一細胞のみな らず細胞集合体も含まれる。 微生物細胞と しては、 細菌， 酵母， 糸状菌， 放線菌等 各種の微生物を含む。
    [0093] 植物細胞と しては、 高等植物の細胞及び細胞集合体， 藻類の細胞及び細胞集合体が含まれる。
    [0094] 本発明に適用でき る通気用気体と しては、 用途に応じ、 空気， 酸素， 炭酸ガス単独も し く は任意の組成に混合 し たガス又は不活性ガスを混合したガスが用い られる。 一 般に動物細胞培養には、 酸素含有ガス， 植物培養用 には 炭酸ガスまたは炭酸ガス含有ガスを使う 。
    [0095] 疎水性材料の濾過膜は、 従来用い られてきた親水性濾 過膜に比べて膜面への細胞等の付着が少ない。 また、 逆 法によっても付着 した細胞等が容易には く 離する作用 が あ る ので、 目詰 り が起 り に く く 、 従って間欠的に逆洗を 実施する こ と によって高効率の細胞の培養ができ る。
    [0096] また、 本発明の消泡手段によって、 効果的な培養液の 消泡を行う こ と ができ るので、 細胞の培養を効率的に行 う こ と ができる。
    [0097] ¾下、 本発明を図面を しめ して具体的に説明する。
    [0098] 第 1図は本発明による細胞培養システムの一実施例の 構成を示した図である。
    [0099] 培養槽 2では、 細胞は培養液 1 に分散懸濁状態で培養 される。 培養槽の底部には液中に酸素含有ガスを通気す るための ノズル 4があ り 、 細胞の生育に必要な酸素及ぴ、 P Hを調節するための炭酸ガスを供耠する。 すなわち、 溶存酸素濃度が一定となるよう にエアーコンプレッサ — 1 6 ょ リ空気、 及びボンべ 1 7 から酸素含有ガスをそれ ぞれ流量制御され、 さ らに、 p Hが 7 . 0〜 7 . S となる ようボンべ 1 8 よ り炭酸ガスを流量制御し、 除菌フィル タ 7 を通過させた後ノズル 4 よ り吹込まれる。 液中に吹 込まれたガスは気泡となって培養液上面に向って浮上す る際に培養液を流動させる。 吹込まれたガスによる槽内 での培養液の流動を劾率よ く行わせるため、 ドラ フ トチ ユーブ 3 が設置されている。 液面に到達した気泡はその まま破泡するこ とな く泡層を形成するので、 液面上に撥 水性材料で形成された消泡層 5 に接触させる ことによ り 効率良く破泡される。 ガスは ミ ス トセノ、。レータ 6 ， フィルタ 7 を経て排ガス 2 4 と して培養槽外に排出される。 なお、 培養槽 2 には、 溶存酸素濃度や p Hを一定にするための手段， 槽内及び 配管内を殺菌するための手段， 培養液の注入， 排出のた めの手段， 温度を一定に保っための手段， 溶存酸素濃度， p H， 温度， 槽内圧等のセンサゃ槽内の培養液の液面を 検出するセンサ等、 各種の装置が設置されているが第 1 図ではこれらは省略した。
    [0100] 培養槽 2 の下部には瀘過器 8 が設けられている。 瀘過 器 8 内には多孔質中空糸膜フ ィルタ 1 0 が設置されてお り、 その上部あるいは周囲に濾過助材 9 が充填されてい る。 濾過助材 9 は保持フ ィルタ 1 1 によ り保持されてい る。
    [0101] 中空糸膜フィルタ 1 0 は、 殺菌時および逆 時等の液 が急速に移動する時でも、 形状が変形した り 、 濾過助材 9層よ り露出した り しないよ う に留意しなければな らな いが、 特にその形状は限定されない。
    [0102] Λ 第 8 図 Α及び Β は本実施例に用いた疎水性中空糸膜ュ ニッ ト を説明するものである。 膜ま持部材 5 0 は 1 3 0 °Cでも剛性を有し、 かつ培養液にょ リ腐食する恐れのな い材料で作成されてお り 、 その外形は第 1 図中の濾過器 8 の内部形状にあわせて作られてお り 、 多少の外力が作 用 しても瀘過器内での位置が移動しない様設けられてい る。 膜支持部.材 5 0 には第 8 図 Aに示すよう に中空糸膜 を保持するための小孔 5 5 が多数設けられている。 穴の 大きさは中空糸膜を自由に通すこと ^できる程度がよい。 第 8図 Bは膜支持部材 5 0 に中空糸膜 1 0 を装着してな る濾過ユニッ ト を示したものである。 中空糸膜 1 0 は 1 本で該濾過ユニッ ト を構成してもよいが、 通常は 2本 J¾ 上の中空糸膜で構成することが好ま しい。 この場合は複 数の中空糸膜を膜接続部材 5 1で 1つに結束して使用す ると、 濾過器への濾過ユニッ トの装着を容易にする こ と ができる。
    [0103] 第 9 図 A及び B は、 膜接続部材 5 1 の概念を示す図で ある。 この膜接続部材は疎水性中空糸膜のうち、 特に接 着法や溶接法では、 膜の接合が困難な村料からなる中空 糸膜、 例えばテ トラ フルォ ロエチレ ン樹脂でつ く られた 中空糸膜の接合に有効である。
    [0104] 第 9 図 Aは、 膜接続部材 5 1 を中空糸膜が接続される 面の反対の面を示す図である。 膜接鐃部材 5 1 に膜拡張 部材 5 2 が包含され、 膜接続部材 5 1 の外面は円形に整 形されている こと が望ま しい。 第 9 図 B は、 第 9 図 Aの A - Α ' 断面を示す図である。 中空糸膜 1 0 に、 中空糸 膜の内径と同程度の内径を有し、 外径が中空糸膜内径よ リ も大であ り、 その先端部が中空糸膜内面に揷入しゃす いよう にテ一パ拔に成形されておリ、 かつ局部的に外径 の大な る突起部分を設け、 中空糸膜の離脱を防いでい る。 次いで膜拡張部材 5 2 を揷入 した部分を膜接続部材 5 1 で包含し、 硬化させる こ と によ り 、 中空糸膜を強固に結 束する こ と ができ る。 膜接続部材と しては特に限定する ものではないが、 細胞に悪影響を与えず、 培養液中で腐 食せず、 かつ 1 3 0 °C前後でのスチーム殺菌に耐える材 料であればよい。 例えば 2液硬化型のエポキシ樹脂が用 い られる。
    [0105] 培養液の交換は以下のよ う に実施さ れる 。 第 1 図の弁 3 1 及び 3 2 を閉 じ、 弁 3 3 を開いてポンプ 2 2 を作動 させる と培養槽 2 よ り培養液 1 が濾過器 8 に導かれる 。 培養液中の細胞は濾過助材 9 及び多孔質中空糸 フ ィルタ 1 0 を通過する過程でそれぞれの表面で捕捉さ れる。 多 孔質中空糸 フィルタ 1 0 は濾過助材 9 の粒子及び細胞を 透過 しない開孔度のもの を選定した。 細胞を濾過 した培 養濾液は、 培養濾液貯槽 1 5 に貯留される。
    [0106] 所定量の培養液を培養槽 2 から排出 した後、 ポンプ 2 2 を停止し、 弁 3 3 を閉 じ る。 次いで弁 3 1 ， 3 2 を 開き、 ポンプ 1 9， 2 0 を作動させる 。 ポンプ 1 9 , 2 0 は新鮮培養液貯槽 1 2 よ リ新鮮培養液を瀘過器に供 紿する 。 こ の と き 、 ポンプ 1 9 は濾過器 8底部よ り新鮮 培養液を供給 し、 瀘-過助材 9 の充瑱層 を浮上させ、 展開 させる よ う流量を設定する。 また、 ポンプ 2 0 は多孔質 中空糸膜フィルタ 1 0 に逆洗のため新鮮培養液を逆に圧 力し、 フィルタ 1 0表面に付着した細胞等の固形物をは く離させる。 なお、 ポンプ 1 9及び 2 0 の流量の合計は 濾過助材 9 が瀘過器周囲よ り散逸する こ とのないよう調 節する。
    [0107] 前述の濾過工程で滤過助材 9及び中空糸膜フィルタ 1 0上に捕捉されていた細胞は瀘過助.材 9 の展開によ リ 充塡層内から解放される。 瀘過助材 9 の粒子はその沈降 速度が細胞よ り大き く なるよう比重， 粒径， 形状が選定 されているので、 細胞は展開した充填層の上部まで淳遊 し、 新鮮培養液と とも に培養槽 2 に戾される。
    [0108] 第 2 図は本発明による細胞培—養システムの他の実施例 の構成を示すもので る。 本実施例の特徵は、 瀘過器 8 に用いた濾過助材 9 と して、 培養液比重よ リ小なる粒子 を用いた点にある。 濾過助材 9 と しては中空ガラスビー ズ， 中空力一ボンビーズ等が用いられている。 濾過助材 9 は濾過器 8の上部及び底部に設けられた 2枚の保持フ ィルタ 1 1 によ リ保持されている。 保持フ ィルタ 1 1 の 開口度は濾過助材 9 の粒子は透過させないが、 細胞は自 由に透過させるものを選択する。
    [0109] 本実施例によれば、 濾過器の逆洗時に濾過助材 9充塡 層及び中空糸膜フ ィルタ 1 0 に捕捉されている細胞を、 よ リ完全に培養槽に戻すことができる。 第 3 図は本発明による細胞培養システムの他の実施例 の構成を示したものである。 本実施例の特徴は、 第 1 図 の実施例に老廃成分除去手段を付加した点である。 なお、 本実施例での老廃成分除去手段と しては、 限外濾過法を 用いている。
    [0110] 培養濾液貯槽 〗 5 には配管によ り限外濾過器 1 4 が接 続されている。 限^濾過器 1 4 には分画分子量 10， 000の 限外濾過膜が用い られており、 乳酸， アンモニア等の老 廃成分を透過し、 ホルモン等の細胞の生育に有用な物質 は透過させない。 培養瀘液はポンプ 2 3 によ り 限外濾過 器 1 4 に圧入され、 限外濾過膜と接続している間に老廃 成分等の低分子物質は膜を透過し、 老廃成分 2 6 と して 系外に排出される。
    [0111] 限外瀘過器 1 4で老廃成分を除去した液は老廃成分除 去液貯槽 1 3 は貯留される。 なお、 限外瀘過によ り濾過 される液量はわずかであるため、 ポンプ 2 3 によ り限外 濾過器 1 4 と老廃成分除去液貯槽の間で、 循環して濾過 を行い、 老廃成分を除去する。 通常、 老廃成分除去液を 新鮮培養液の一部と して再利用 した場合に老廃成分濃度 が、 轧酸と して 1 0 0 0 p p m 以下、 好ま し く は 1 0 0 P P m 以下、 アンモニアと して 2 0 p p m 以下好ま し く は 5 P P m 以下と なるよ う にする必要がある。
    [0112] 老廃成分除去液は、 ポンプ 2 1 を作動させる こ と によ リ濾過器 8 の逆 液の一部と して新鮮培養液に加えられ、 培養槽 2 に戾され、 再び細胞の増殖に利用される。 老廃 成分除去液中には、 培養瀘液.中に残存していたホルモン や生育因子等の有効成分が多量に含まれている他、 細胞 自身が分泌する生育増長因子や有用生産物も含まれてい るので、 これを用いるこ とは細胞の生育に良好な結果を 与える。
    [0113] 第 4図は本発明による細胞培養システム他の実施例の 構成を示したものである。
    [0114] 本実施例の特徵は、 第 3 図に示した実施例において、 濾過器 8 に用いた濾過助材 9 と して、 培養液比重よ り小 さい比重の粒子を用いる点にある。 濾過助材 9 と しては 中空ガラスビース、 中空カーボンビーズ等が用い られて いる。 濾過助材 9 9 は濾過器 8 の上部及び底部に設けら れた 2枚の保持フィルタ 1 1 によ り保持されている。 保 持フィルタ 1 1の開口度は濾過助材 9 の粒子を透過させ ず、 細胞を自由に透過させるものが選択されている。 そ の他は第 3図と同じである。
    [0115] 本実施例によれば、 瀘過器の逆洗時に濾過助材 9充¾ 層及び中空糸膜フィルタ 1 0 に捕捉されていた細胞をよ y完全に培養槽に戻すこ とができる。
    [0116] 第 5 図は、 本発明による細胞培養システムの他の実施 例の構成を示したものである。 本実施例の特徵は、 第 3 図に示す実施例.において、 疎 水性膜 1 0 を培養槽 2 の上層に設けたこ と、 及び撹拌機 を取付けたこ と にあ る。 本実施例における培養液の交換 は以下のよ う に実施される。 弁 3 3 を開き、 弁 3 2 を閉 じてポンプ 2 2 を作動させる と 中空糸膜の内部が減圧さ れる。 その結果、 培養液中に浮遊している細胞は中空糸 膜の表面に捕捉さ れ、 膜内には細胞を含まない培養濾液 が抜き出さ れ、 培養濾液貯槽 1 5 を貯留される 。
    [0117] 所定量の培養瀘液を培養槽 2 から排出 した後、 ポンプ 2 2 を停止し、 弁 3 3 を閉 じ る。 次いで弁 3 2 を開き、 ポンプ 2 0 及び 2 1 を作動させる。 ポンプ 2 0 は新鮮培 養液貯槽 1 2 よ り新鮮培溶液を、 ポンプ 2 1 は老廃成分 除去液貯槽 1 3 よ り老廃成分除去液を供耠する 。 新鮮培 養液及び老廃成分除去液は中空糸膜内に圧入さ れ、 膜面 の細孔よ り培養糟 2 内に流入する。 この際、 中空糸膜の 外面や細孔内に吸着していた細胞等の固形物を剥離し、 滤過面の再生を行う 。 疎水性膜 1 0 は膜面への細胞やご み等の附着を防止するため、 でき る だけ培養液の移動速 度の犬なる所に設ける こ と が好ま しい。 本実施例のごと く 、 撹拌翼 2 9 を設け、 その周囲に疎水性膜を設置すれ ば、 撹拌翼の回転によ り吐出さ れる培養液の流れで膜面 の固形物が滞留する こ とな く 移動する ため、 膜面への沈 積を効果的に防止する こ と ができ る。 本実施例に用いる濾過ユニッ トの形状は、 特に限定す るものではないが、 - 培養液の流動をさ またげず、 かつ細 胞に不要な外力を与えないよ う な形状である ことが望ま しい。 第 1 0 図〜第 1 3図に示した各濾過ユニッ トは、 本実施例に特に好ま しい形状である。
    [0118] 本実施例によれば、 濾過を培養槽中で行う ため、 瀘過 時に酸素の欠.乏ゃ温度の低下を招く ことがなくな り、 細 胞の増殖を良好に保つこ と ができ る。
    [0119] 第 6 図は本発明による細胞培養システムの他の実施例 の構成を示したものである。 本実施例の特墩は、 第 5 図 に示す実施例において、 培養液調製槽 4 1 を付加した点
    [0120] I ある。
    [0121] 培養槽内に設けられた疎水性中空糸膜の逆洗に用い ら れる逆洗用液は、 あ らかじめ新鮮培養液及び老廃成分除 去液を、 培養液調製槽 4 1 で混合， 調製する。 培養液調 製槽 4 1 にば、 乳酸， アンモニア， たん白質の濃度を測 定する手段が付設されており、 新鮮培養液及び老廃成分 除去液の混合割合を調節する。
    [0122] 本実施例によれば、 細胞の増殖に好適な培養液を常に 用いて培養を行う ことができる。
    [0123] 第 7 図は本発明による細胞培養システムの他の実施例 の構成を示したものである。 本実旌例 φ特徵は第 s図に 示す実施例において、 老廃成分除去装置と して限外瀘過 器にかえ、 拡散透析器を用いたこ とである。
    [0124] 培養濾液は配管によ り 拡散透析器 4 4 に導か'れ、 ポン プ 2 3 によ り老廃成分除去液貯槽 1 3 と、 拡散透析器 4 4 の間を循環させる。
    [0125] また、 低分子成分液貯槽 4 2 には、 各種ア ミ ノ酸， ビ タ ミ ン， 無機塩類， グルコース等の低分子成分を溶解 し ている低分子成分液が貯留されてお り 、 ポンプ 4 7 によ り 、 拡散透析器に送られる 。 拡散透析器 4 4 内で培養濾 液は透析膜を介して低分子成分液と接触し、 その間に透 析膜を通過 し う る低分子成分の透析が行われる。 すなわ ち、 培養濾液中に含まれた乳酸やアンモニア に代表さ れ る老廃成分が低分子成分液中に拡散する と と も に、 低分 子成分液中に溶解されている各種のア ミ ノ酸， ダルコ一 ス， 各種の無機塩類， ビタ ミ ン類が培養濾液中に拡散す る。 細胞の増殖に有益な各種のホルモン， 生長因子等の 高分子成分は透析される こ とな く そのま ま廃成分除去液 中に と どま る 。 透析は、 乳酸濃度が 1 0 0 0 p pm 以下、 好ま し く は 1 0 0 p p m 以下、 アンモニアは 2 0 p p m 以下、 好ま し く は 5 ρ ρ πι 以下となる よ う実施する 。
    [0126] 拡散透析によ リ老廃成分を除去した老廃成分除去液は、 ポンプ 4 6 によ り培養液調製槽 4 1 に送 られる 。 該培養 液調製槽には、 高分子成分液聍槽 4 2 か らポンプ 4 5 に よ り高分子成分液が供給され、 前記老廃成分除去液と混 合， 調整する こ と によ リ新鮮培養液となる。 高分子成分 液中には、 血清， ホルモン等透析膜を透過できない高分 子成分が溶解している。 なお、 該培地調製槽 4 2 には、 乳酸アンモニア， たん白質の濃度を測定する手段を付設 し、 その測定値をも と に高分子成分液と老廃成分除去液 との混合割合を調整する。
    [0127] 本実施例によれば、 常に細胞の増殖に好適な培養液を 調製するこ と ができ るので、 細胞を高濃度培養する こ と ができる。
    [0128] 第 1 0 図は、 第 6 図の老廃成分除去手段を吸着箇に替 えたものである。
    [0129] アンモニアの吸着にはゼオライ トを、 乳酸の吸着には 乳酸デヒ ドロゲナ一ゼを不溶担体に固定して用いた。 な お、 該吸着筒は複数本設けておき、 適宜配管を切替える こと によって培養工程に影響無く吸着， 再生を行う こ と ができる。 本実施例によれば、 老廃成分のみ選択的に除 去できるので、 培養液のロスが少ない。
    [0130] 次に、 よ り具体的な実施例を示し説明する。
    [0131] 実施例 1
    [0132] 外径 2 mm， 内径 l mm， 細孔径 0 . 8 μ πι ， 長さ l mの テ ト ラ フルォ □エチ レ ン樹脂からなる琼水性中空糸膜
    [0133] (住友電気化学工業製、 -T B - 2 1 ) のそれぞれの両末 端に、 最大外径 2 . 5 mm ， 内径 0 . 9 mm ， 長さ 3 O mmの 第 9 図に示す断面を有する SUS316製の膜拡散部材 5 2 に 挿入した。 次いで、 上記中空糸膜 4本を揃え、 内径 1 5 mm, 深さ 3 0 mmの円筒形の硬化用.型に挿入 した。 これに 2液混合硬化型のエポキシ樹脂剤 （チバガイ ギー製， ァ ラルダイ トラ ピッ ド） を、 主剤と硬化剤を混合したのち 直ちに上記の硬化用型内に注入し、 遠心分離機を用いて 1 ， 0 0 0 G の遠心力をかけ、 その間に硬化せしめた。 完全に硬化した後、 硬化用型よ り硬化物を取り だし、 そ の末端を 5 nrnに切斬した。
    [0134] 上記で製作した中空糸膜ユニッ トについて、 その両端 から 1 3 0 °C , ゲージ圧 1 . 8 kg Zcm2の蒸気を通じ、 1 時間保持した。 室温まで冷却した後、 中空糸膜の .1 本に ついて l kgの引っ張 り荷重をかけても中空糸膜は膜接続 部材 5 1 から抜ける こ とは無かった。
    [0135] 比較例 1
    [0136] 実施例 1 において、 中空糸膜の両端に膜拡張部材 5 2 を揷入する こ とな く エポキシ接続剤で固定し、 中空糸膜 ユニッ ト を製作した。 次いで、 その両端から 1 3 0 °C， ゲージ圧 1 . 8 kgノ cm2の蒸気を通じ、 1 時間保持した。 室温まで冷却した後、 中空糸膜の 1本について 1 kgの引 つ張り荷重をかけたと ころ中空糸膜は膜接続部材 5 1 か ら拔けて しまった。 - 実施例 2 イーグル M E M培地 （日水製薬製イーグル M E Mニッ スィ①） 9 .4 g / i2 , グルタ ミ ン 0 . 2 9 2 g Z £ ，
    [0137] - 7 . 5 % 炭酸水素ナ ト リ ウム水溶液 2 9 m β / β ， ダル コース 2 0 g Z J2 、 及び牛胎児血清 1 0 0 m £. Ζ β を加 えた培養液 5 m £ に、 ラッ ト肝臓の癌細胞株 J T C一 1 (Japan Tissue Culture Not 1 )を接種した傷平フラスコ 1 5ケを静置培養した。 培養温度は 3 7 °C， 気相ガスは 空気と した。
    [0138] 3 日間培養したフ ラスコの表面に讨着した細胞を剥離 し、 細胞濃度 5. 1 X 1 05 個ノ ιη β の培養液 7 5 m £ を得た。 本培養液を遠心分離し、 上澄みを捨て、 同容量 の新鮮な培養液に懸濁した。
    [0139] 次に、 直径 1 1 0 mm， 長さ 1 7 1 mm， 容積 1， 2 5 0 m β のローラーボ トルに上記細胞懸濁液 7 δ m 及び上 記の新鮮な培養液 1 7 5 m fi を入れて、 3 7 C、 気相ガ スは空気、 2rPm にて 3 日間培養した。 次いで、 培養液 を遠心分離し、 上澄みを捨て同容量の新鮮な培養液に懸 濁した。 そして再び上記条件下で 3 日間培養した。 培養 液を遠心分離して上澄みを捨て、 2倍量の新鮮な培養液 に懸濁し、 それを 2倍の本数のローラーボ トルに分割し、 再び上記条件下で 3 日間培養した。
    [0140] 上記の操作を更に 2回繰り返し、 1 . 7 X 1 0 S個 Z πι β の種培養液 2， 0 0 0 m fl を得た。 本培養液を遠心 分離して上澄みを捨て、 同容量の新鮮な培養液に懸濁し た。 '
    [0141] 次に、 第 1 図に示す細胞培養システムの直径 1 6 5 mm， 高さ 3 5 0 mm, 容量 7， 0 0 0 m £ の円筒型のステン レ ス製培養槽に、 上記種細胞懸濁液 2， O O O m J2 及び培 養液 3， 0 0 0 m fi を入れて （合計 5， 0 0 0 m fi ) 3 7 °Cに保温した。 液面上 5 0 mmの高さ に表面にシラ ン系有 機珪素ポリマ （粘度 1 X 1 0 5 センチボイ ズ） を薄く 塗 布した正方形網目のステン レス網 （目 の 1辺の長さ ： 3 mm) を置き、 槽底部に配置した直径 6 0 mmリ ングスパー ジャ （孔径 l nm， 1 0ケ） から酸素含有ガスを通気して 培養した。 _酸素含有ガスの通気量は培養液の溶存酸素濃 ( D O ) が 2 . 5 ppmと なるよ う に、 空気量及び酸素量 を 自動的に調節する溶存酸素濃度調節装置によ リ調節し た。 また、 培養液の P Hが 7 . 0〜 7 . 6 の範囲となる よ う に p H調節装置によ り炭酸ガスを酸素含有ガスに加え て通気した。
    [0142] 培養槽の下部には配管によ リ濾過器が接続されている。 濾過器底部にはま持フィルタ ーがあ り、 親水性濾過助材 層を保持している。 親水性濾過助材層の中には疎水性中 空糸フ ィルタ ーュニッ 卜が埋没している。 疎水性中空糸 フィルタ ーユニッ トは、 第 8 図 B に示した，状に、 長さ 1 . 2 mm の疎水性中空糸膜フ ィルタ ー 4本を用いて実旅 例 1 の手法によ り作成したものである。 親水性濾過助材 と しては直径 7 0 mのガラスビーズをェチルアルコ一 ル処理によ リ親水化した.ものを用いた。
    [0143] 引き抜き用ペリ スタ リ ックポンプを用いて中空糸膜フ ィルター内部を減圧する こ と によ-り、 2 0 m β /min の 流速で培養濾液を引き抜いた。 培養濾液内八の細胞の混 入は全く認め られなかった。 引き抜き量が 5 0 0 m β に 達した時、 引き抜き用ペリ スタ リ ックポンプを停止した。 次いで、 中空糸膜フ ィルター逆洗用ペリ スタ リ ックポン プ及ぴ濾過助材層展開用ペリ スタ リ ックポンプを用いて 中空糸膜フィルタ ー逆洗及び濾過助材層展開を行った。
    [0144] 中空糸膜フィルタ 一逆洗は 8 0. m β / min の流速で 2 分間行った。 濾過助材層展開は、 中空糸膜フィルタ ー逆 洗中は O m fi Zniin 、 中空糸膜フィルタ ー逆洗終了後 は 1 5 0 m β / min の流速で行い、 引き抜き量と同量を 培養槽内に注入した時点で終了するよう に制御した。 中 空糸膜フィルタ ー逆洗及び濾過助材展開には新鮮培養液 貯槽に調製しておいた新鮮培養液を用いた。 培養液の瀘 過、 及び中空糸膜フィルター逆洗及び濾過助村層展開は、 培養槽内の培養液が 1 日あたり 1回入れ替わるよう に 1 日あた り 1 0 回実施した。
    [0145] - 本実施例の結果第 I S図に示した - 培養開始 1 2 日以 後 1 X 1 07 細胞 Ζ πι β以上、 生存率 8 8 %以上を維持 できた。 最高細胞濃度は 1 .6 X I 07細胞/ m fi であつ た。
    [0146] 比較例 2 .
    [0147] 第 1 図の培養システムよ り濾過器、 中空糸膜フ ィルタ 一及び濾過助材を除いた培養システム を用いて実施例 2 と同 じ培養を行った。 その結果を第 1 7 図に示 した。 濾 過器、 中空糸膜フィルタ 一及び濾過助材を除いたこ と に よ り培養液の交換が出来ず、 栄養成分が枯渴 して細胞濃 度が 2. 1 X 1 06細胞ノ m J2 に達し たあ と急速に減少 し た。 これよ り 、 培養液の交換が不可欠である こ と がわか る。
    [0148] 比較例 3
    [0149] 第 1 図の培養システムにおいて、 酸素供給を液面通気 によ リ行う培養システム を用いて実施例 2 と 同 じ培養を 行った。 その結果を第 1 8 図に示 した。 細胞濃度は最高 5.6 X 1 06細胞 Z m fi であ り 、 生存率が徐々 に低下 し た。 この結果は細胞の増殖に必要な酸素が不足 している こ と を示している。 すなわち、 液面通気法では酸素の供 紿が充分でない こ と がわかる。
    [0150] 比較例 4
    [0151] 第 1 図の培養システムよ リ消泡層 を除いた培養シスチ 厶 を用いて実施例 2 と 同 じ培養を行った。 その結果、 培 養廃ガス管よ り泡が流出 した。 これよ り 、 液中通気によ る酸素供給を行う ためには、 培養槽内に消泡手段が必要 である こ と がわかる。
    [0152] 実施例 3
    [0153] 実施例 2の手法によ り細胞濃度 1 .8 X 1 0 s個 Zm £ の種細胞懸濁液を調製した。 次いで、 第 6図に示した細 胞培養システムによる培養を行った。 本システムの培養 槽は内容積 7， 0 0 0 πι β の SUS316製円筒型をなしてお リ、 培養液の流動を行わせるために撹拌機 2 9 を設けた。 細胞と培養液とを分離するための琼水性中空糸膜フ ィル タ一ユニッ ト 1 0 は、 第 1 3 図に示す形状を有しており 撹拌翼の回転面の周囲に設けた。 なお、 竦水性中空糸膜 フィルタ 一ユニッ トは、 長さ 1 . 5 m の実施例 1で用い たものと同じ中空糸膜フィルタ一を 4本用いて作成した。 酸素供給手段， 消泡手段及び培養条件は実施例 2 と同じ と した。
    [0154] 培養樽に上記種細胞懸濁液 2， 0 0 0 m β 及び実施例 2 と同じ培養液 3 , 0 0 0 m fi を入れて （合計 5 , 0 0 0 m fl ) 、 3 7 °Cに保温した。 培養開始後 2 日間は回分培 養を行い、 3 日 目よ り培養液の交換を実施した。 中空糸 膜フィルタ一の内部をペリ スタ リ ックポンプを用いて減 圧し、 1 0 m ΰ / m.in の流速で培養濾液を引きぬいた。 培養濾液中への細胞の混入は全く 認め られなかった。 引 きぬき量が 5 0 0 m β に達したと き、 引きぬき用べリ ス タ リ ックポンプを停止 した。 次いで、 中空糸膜フ ィルタ -—逆洗用ペ リ スタ リ ッ クポンプによ り新鮮な培養液を 2 0 0 m β / min の流速で中空糸膜フィルタ ー 1 0内に 圧入 し、 中空糸膜フィルタ 一 1 0の逆洗を行った。 逆洗 に用いた培養液は、 イ ーグル M E M培地 9.4 g / β , グルタ ミ ン 0.2 9 2 g Z J2 ， 7.5 %炭酸水素ナ ト リ ウ ム水溶液 2 9 m £、 及び牛胎児血清 5 0 ιη β / β の組成 からな り 、 新鮮培養液貯槽 1 2に貯留 した。 逆洗は培養 瀘液引き ぬき量と 同量を培養槽に注入 した時点で終了す る よ う に制御 した。 滤過及び逆洗は、 培養糟内の培養液 が 1 日 に 1回入れ替る よ う に、 1 日 あた り 1 0回実施し た。
    [0155] 引 きぬいた培養瀘液は培養濾液貯槽 1 5 に貯留 した。 そののち、 限外濾過器 1 4 によ り老廃成分を含む低分子 成分を濾過し、 高分子成分を濃縮して老廃成分除去液貯 槽 1 3に貯留 した。 老廃成分除去液の容積が培養濾液の
    [0156] 1 / 1 0になる まで、 限外濾過器 1 4 と老廃成分除去液 貯槽 1 3の間をペ リ スタ リ ックポンプによ り循環 した。 限外濾過膜は分画分子量 1 0 , 0 0 0 のも の を用いた。
    [0157] 培養開始後 8 日 目 よ り 、 培養液調製槽において、 新鮮 培養液 9 Ο Ο ιη に対し老廃成分除去液を 1 ( Ο ιη β の 割合で混合 し、 これを中空糸膜フ ィルタ 一 1 0の逆洗に 用いた。 培養開始後 1 8 日 目 よ り、 培養槽内の培養液が 1 日 に 2回入れ替るよう に、 濾過、 及び逆洗の回数を 1 日あた ϋ 2 0 回に増加した。
    [0158] 本実施例の結果を第 1 9 図に示した。 限外濾過によ リ 老廃成分を除去した結果、 実施例 2での場合に比べ乳酸 及びアンモニアの濃度が低下している。 空に最高細胞濃 度が 2 . 8 X 1 07個 Z m β に達しており、 本実施例の効 果が認め られる。
    [0159] 実施例 4
    [0160] 実施例 2 の丰法によ り細胞濃度 1 . 1 X 1 06個 Ζ πι β の種細胞懸濁液を調製した。 次いで、 第 7 図に示した細 胞培養シ テムによ る培養を行った。 本システムは実施 例 3 にて使用 した第 6 図に示す培養システムの老廃成分 除去手段のみを拡散透析 4 4に替えたものである。 酸素 供給手段， 消泡手段， 培養液交換手段及び培養条件ば実 施例 3 と同 じ と した。
    [0161] 培養槽に上記種細胞懸濁液 2， 0 0 0 in β 及び実施例 2 と同じ培養液 3， 0 0 0 πι β を入れて （合計 5， 0 0 0 m β ) 、 3 7 でに保温した。 培養開始後 2 日間は回分培 養を行い、 3 日 目 よ り培養液の交換を実施した。 中空糸 膜フィルタ 一 1 0 の内部をペリスタ リ ックポンプを用い て減圧し、 1 5 m β /min の流速で培養瀘液を引きぬき、 培養滤液貯槽 1 5 に貯留した。 培養濾液中への細胞の混 入は全く認め られなかった。 引きぬき量が 5 0 0 m J2 に 達したと き、 引きぬき用ペリ スタ リ ックポンプを停止し た。 - 培養濾液貯槽 1 5 よ り培養滤液をぺリ スタ リ ックポン プで拡散透析器 4 4 に送液し、 老廃成分を含む低分子成 分を拡散透析によ り除去した。 拡散透析膜と しては、 分 子量 6， 0 0 0 以下の物質を透過し、 それ以上の物質を 透過させないものを用いた。 拡散透析では、 対称液と し て、 イ ーグル M E M培地 9 . 4 g / β ， グルタ ミ ン 0 . 29 2 g / J2 , 7 . 5 % 炭酸水素ナ ト リ ウム水溶液 2 9 m £ / β 、 及ぴグルコース 2 0 g / J からなる低分子成分液を 用い、 培養濾液に対し 2倍の流量を瑋じて行った。 老廃 成分を含む低分子成分を除去した老廃成分除去液は老廃 成分除去貯槽に貯留 した。
    [0162] 培養液調製槽において、 老廃成分除去液に牛胎児血清 を 1 。/。になるよ う に加えた。 これを中空糸膜フィルター 1 0 にペ リ スタ リ ックポンプによ り 2 0 0 m J2 / min の 流速で圧入し、 中空糸膜フィルタ ー 1 0 の逆洗を行った。 逆洗は.培養濾液引きぬき量と同量を培養槽に注入した時 点で終了するよ う に制御した。 濾過及び逆洗は、 培養槽 内の培養液が 1 日 に 3 回入れ替るよ う に、 1 日 あた り 3 0 回実施した。
    [0163] 本実施例の結果を第 2 図に示した。 拡散透析にょ リ老 廃成分の除去を行ったこ と によ リ、 乳酸及ぴアンモニア の濃度を低くする こ と ができ、 その結果、 最高細胞濃度 が 3 . 0 X 1 07個 Z m β に達した。
    [0164] 比較例 5
    [0165] 第 1 図に示す培養装置において、 疎水性濾過膜に替え て親水性濾過膜 （アミ コン製， ダイアフ ロ一ホ ローファ ィバーシステム， D H— 1 ， 中空糸膜 ： H I M P 0 1 — 4 3 , 孔径 O . l m)を用いて、 実施例 2 と同様にして 細胞培養を行った。
    [0166] その結果、 濾過膜の逆洗を行ったが、 濾過流量が急速 に減少し、 培養開始から 6 日 目で目詰 リ を起こし、 その ため培養を継続する ことができなかった。
    [0167] 実施例 5
    [0168] ラッ ト肝臓の癌細胞株 J T C 一 1 (Japan tissue culture ¾ 1株） を下記培地 5 m S を分注した扁平フ ラ スコ 1 5ケを静置培養した。
    [0169] 培養温度は 3 7 °C、 気相ガス組成は .5 %炭酸ガス混合 空気と した。
    [0170] 培地組成
    [0171] グルコース 1 0 0 0 m g / JS グルタ ミ ン 2 0 0 " ァスパラ ギン酸 1 0 0 '·' ダルタ ミ ン酸 5 0 ！! グ リ シン 1 0 m ァ ラ ニン 1 0
    [0172] ロ イ シン 2 0
    [0173] イ ソ ロ イ シン 2 0
    [0174] バ リ ン 1 5 it アルギニン 1 0 m g シスチン 1 〇 II シスラ イ ン 1 0 I! セ リ ン 2 〇
    [0175] ス レ才ニン 1 5
    [0176] リ ジン 1 0
    [0177] メチォニン 1 0
    [0178] ク ェン酸ソ ーダ 2 5
    [0179] クェン酸 1 0
    [0180] α —ケ ト グルタ ール類 1 5
    [0181] ピオチン 0 . 1
    [0182] サイ ア ミ ン 〇 . 1
    [0183] ピ リ ドキサ一ル 0 . 0 1
    [0184] ニコチン酸 . 0 . 0 1
    [0185] リボフ ラ ビン 0 . 0 2
    [0186] イ ノ シ トール 0 , 1
    [0187] ビタ ミ ン B i 2 0 . 0 0 1
    [0188] ダルタ チオン 1 塩化ナ ト リ ウム 5 0 m g 塩化カ リ ウム 5 0
    [0189] 塩化マグネシウム 1 0 '
    [0190] 塩化カルシウ ム 1 0
    [0191] 塩ィヒマンガン 0 . 0 1
    [0192] 炭水素ナ ト リ ウム 1 0
    [0193] 牛胎児血清 1 0 0 m β
    [0194] Ρ Η 7 .0 計 1 β
    [0195] 3 日間培養したフラスコ の表面に付着した細胞を剥離 し、 細胞濃度 1 . 1-X 1 05細胞 β の種培養液 7 5 m β を得た。 本培養液を遠心分離し、 上澄をすて、 同容 量の液体培地に懸濁した。—
    [0196] 次に、 直径 7 0 mm, 高さ 3 9 0 mm, 容量 I S O O m fi の P3筒形のガラス製培養槽に上記種細胞懸濁液 7 5 m β 液体培地 7 2 δ m β ， 牛胎児の血清 1 Ο ιη β を入れて
    [0197] (合計 9 0 0 πι β ) 、 3 7。Cに保温した。 液面上 1 0 mm の高さに表面にシラン系有機けい素ポリマと してポリ シ ロ キサン （信越化学製 H I V A C — G、 粘度 1 X 1 0 ε センチボイ ズ） を薄く塗布した 正方形網目のスチン レ ス網 （目の 1片の長さ ： 5 mm) をおき、 槽 2底部に配置 した内径 1 mmの単孔ノ ズル 4 から無菌空気を 0 . 2 cm Z sec の速度で通気しつつ、 5 日間培養した。 0 . 2 cmZ sec の通気速度での酸素移動測定は 7 m mo β e O 2/ β • hであった。 この結果、 細胞濃度は 6 X 1 0 S ケ / m β に達した。 この際に生成したア ンモニア濃度は 4 0 PPDi 、 乳酸は 1 1 0 O ppm であった。 溶存酸素濃度は培 養期間中 2〜 5 ppm を維持した。 培養中に発生する気泡 は消泡層 5 に接触し円滑に破泡し、 培養の全期間を通し 消泡層上面から槽気相部に溢流する こ と はなかった。 実施例 6
    [0198] ラッ ト肝臓の癌細胞株 J T C一 1 (Japan tissue culture No. 1株） を下記培地 5 m β を分注した S平ブ ラ スコ 1 5 ケ を静置培用 した。 培養温度は 3 7 °C、 気相ガ ス組成は 5 %混 （ V— V ) 添加と した。
    [0199] 培地組成
    [0200] ダリ コ ース 2 0 0 0 m
    [0201] アルギニン塩酸塩 1 2 6
    [0202] シスチン 2 4
    [0203] グルタ ミ ン 2 9 2
    [0204] ヒ スチジン塩酸塩 4 2
    [0205] イ ソ ロ イ シ ン 5 2
    [0206] ロ イ シン 5 2
    [0207] リ ジン塩酸塩 7 3
    [0208] メチォニン 1 5
    [0209] フエ二ルァ ラ ニン 3 2
    [0210] ス レオニン 4 8 ト レプ 卜 ファン 1 0 m g / β チ口シン 3 6
    [0211] バ リ ン 4 6
    [0212] チア ミ ン 1 . 0
    [0213] レボフ ラ ビン 0 . 1
    [0214] ビリ ドキサール 1 . 0
    [0215] パン 卜テン酸 1 . 0
    [0216] ニコチン酸 1 .0
    [0217] ピオチン 0 . 0 2
    [0218] コ リ ン塩酸塩 1 . 8
    [0219] 1 . 0
    [0220] イ ノ シ 卜一ル 2 . 0
    [0221] 塩化ナ ト リ ウム 8 0 0 0
    [0222] 塩化カ リ ウム 、 2 0 0
    [0223] りん酸水素 2ナ ト リ ウム · 1 2和物
    [0224] 2 0 0
    [0225] 牛胎児血清 . 1 X 1 05
    [0226] Ρ Η 7 . 0 計 1 β
    [0227] 3 日間培養したフ ラスコ の表面に付着した細胞を剥離 し、 細胞濃度 1 . 2 1 X 1 05細胞 Ζ πι β の種培養液 7 5 πι β を得た。 本培養液を遠心分離し、 上澄を—すて、 同容 量の液体培地に懸濁した。
    [0228] 先に、 直径 7 0 mm， 高さ 3 9 0 mni， 容量 1 5 Q O m J の 円筒形のガラ ス製培養槽に上記種細胞懸濁液 7 5 m β ， 液体培地 7 2 5 m J2 ， 牛胎児の血清 1 0 m J2 を入れて
    [0229] (合計 9 0 0 m fi ) 、 3 7 °Cに保温 した。 液面上 0 . 5 の高さ にポリ シ ロ キサン（信越化学製 H I V A C — G ) を塗布 した高さ 5 mmのポリ エチ レ ン製ハニカ ムの消泡層 5 (正六角形穴の一辺 mm) を配置した。 槽底部に配置 し たガラス製多孔質ノ ズル 4 から滅菌処理空気を平均泡径 2 mmの泡径で通気速度 0 . 2 cm secで通気して、 5 日間 培養 した。 この際の培養液の表面張力は S 5 dynZcm2で 培養液液滴と撥水材と の接触角は 9 0 ° であった。 また、 上記通気での酸素移動速度は 7 m mo J2 e 02 ΰ · で あった。 その結果、 細胞濃度は 5 . 2 X 1 0 sケ / m β に 達した。 この際に生成したアンモニアの濃度は 3 5 ppm 、 乳酸は 1 0 5 0 ppra であった。 溶存酸素濃度は培養期間 中 2 〜 5 pPm を維持した。 培養中に発生する液面上の気 泡は消泡層 5で完全に消泡さ れた。
    [0230] 実施例 7
    [0231] 消泡層のみ異なるもの を用い、 その他の培養槽及び培 養条件を同一に して次の試験を行った。 消泡層 5 は、 正 方形網目 のステン レス網 （目 の一片 ： 8 ram) を骨格と し、 これにポ リ ウ レ タ ン樹脂を付着 せて、 目 の一片 を 5 mm に してから、 ポリ シ ロ キサン （ 2 X 1 0 3セ ンチポィ ズ） を 5 %含浸 したもの を用いた。 槽底部に配置したガラス製多孔質ノズル 4 から滅菌処 理空気を平均泡径 2 mmで、 通気速度 0 . 2 mmZsecで通気 し、 5 日間培養した。
    [0232] この際の培養液液滴と撥水材と の接触角は 8 5 ° であ つた。 また、 上記通気での酸素移動速度は 7 m mo β e O 2 β · h であった。 この際に生成したアンモニアの 濃度は 3 6 ρρπι， 乳酸は 1 0 4 0 ppm であった。 溶存酸 素濃度は培養期間中で 6 ppm を維持し、 かつ培養中に発 生する液面上の気泡は消泡層 5下面で完全に消泡された。 5 日間培養後の細胞濃度は 5 . 1 X 1 0 sケ Z m に達し た。 ノ
    [0233] 比鲛例 6
    [0234] 実施例 6 の液中通気方式に対し、 液面通気方式で培養 した。
    [0235] 実施例 6 と同形同容量の培養槽を用意し、 消泡層 5及 び液中通気ノズル 4 を取り はずし、 代り に気相部に液面 に平行して通気配管と排気配管を相対して設置した。 同 一細胞株を同じ要領で種培養した種培養液を同容量、 同 じロッ トの液体培地及び血清を-同じ容量比で入れ、 同じ 通気量にて 3 日間培養した。 この際の酸素移動速度は 0 . 3 m mo β e 〇 2/ ^ · 1ιであった。 また、 溶存酸素濃 度は培養 1 日 目は 0〜 0 . 2 ppm、 3 日 目以降は 8 PRIU で あった。 細胞濃度は 0 . 9 X 1 0 sケノ m £ であった。 本 . 比較例 6 は、 従来技術の一例であ り、 液面通気方式では 細胞増殖に必要な溶存酸素を十分に供給できず、 細胞濃 度は実施例 6 に比べ約 6分の 1 にと どまった。
    [0236] 比較例 7
    [0237] 実施例 6 に於て、 消泡層 5 と して用いるポリ エチレン 製ハニカム層にオ リ一ブ油 （粘度 2 2 センチボイズ） を 塗布したものを用いた。 培養液との接触角は 2 5 ° であ つた。 液中通気によ り生成した泡は消泡層と接蝕し、 3 時間目 までは消泡効果を示したが、 それ以降は消泡効果 を失い、 気泡が消泡層を こえ槽上部の排気口 2 4 から溢 流し運転不能となった。 またオ リ ーブ油が培養液表面に 油膜と して拡散する こ と を観察した。
    [0238] 上記比較例に示すよ う に低粘度の撥水剤と培養液と の 直接接触による消泡は短期間は有効であるが長期間、 効 果を持続する こ とが困難である。
    [0239] 実施例 8 〜 1 5
    [0240] 実施例 6で用いた株化動物細胞を同一組成の液体培地 を用いて培養した。 培養槽 2 と して、 直径 1 5 cm高さ 3 O cjnのガラス製を用い、 槽内底部から高さ 1 O c mの位 置に底面と平行して表に記す各種の消泡層 5 を設置した。 さ らに槽底部には直径 1 0 c mの リ ングスパージャ （孔径 1 mm , 孔数 1 2ケ） を配置し第 1表に示す所定の通気量 で炭酸ガスを 5 % ( V - V ) 富化した無菌空気を通した。 温度は外部ジャケッ トによ リ 3 0 °Cに自動調整した。 培 養期間は 4 日 と し、 その間消泡層の消泡効果及び圧力損 失数の培養期間中における細胞の最高到達濃度を測定し た。 その結果を第 1表内に併記した。 いずれも交カ果的に 消泡できる。
    [0241] 伹し、 実施例 8 における r = 0 . 5 mm のよう に、 消泡 層の孔怪が小さすぎる と圧損が大き く なる。
    [0242] 第 1. 表
    [0243]
    [0244] 第 2 表
    [0245]
    [0246] 比較例 8
    [0247] 実施例 8 と同形の培養槽を用い、 消泡層 5 のみ異なる 構造のものを用いる以外は同一条件で培養した。 消泡層 5 は直径 1 mm長さ 5 cmのスチン レス線を平面上直角に十 字に溶接したものを用い、 交点を槽平断面の中心部に位 置するよ う にした。 すなわち半径 5 O mm内角 9 0 °Cの円 弧状の穴を持つ消泡槽を用いた。 通気量を 0 . 〇 1 cm .ノ s ec の時点では消泡できたが、 0 . 1 cm Z secでは、 泡が 破砕しないう ちに円弧状六をショー トパス し、 培養槽上 部の排気口 2 4 から溢流し運転不能となった。 上記比較 例は消泡層 5 の孔怪'が大きすぎる と消'泡効果が低下する こ と を示している。
    [0248] 実施例 1 S
    [0249] He fi a細胞 （人子宫ガン細胞） を実施例 6 と同一培地 1 0 O m fi の入った 5 0 Ο πι β ガラス製回転培養ビン に 5 X 1 04cell/ m β に接種し、 3 7 °C， 回転速度 1 0 rpDi で 3 日間培養した。 気相ガスは空気と した。
    [0250] 上記の培養した培養ビンの表面に付着した細胞を剥離 し、 細胞濃度 1 . 1'X 1 05細胞 Z m. ώ の種培養液 1 〇 0 m & を得た。
    [0251] 次に、 直径 1 0 4 mm， 高さ 1 6 4 mm， 容量 1 5 0 0 m & の円筒形のガラス製培養槽 2 に上記種細胞懸濁液 1 0 0 m β , 液体培地 7 0 5 m fi 、 子牛血清 9 0 m β を 入れて （合計 9 0 0 m β ) 、 3 7 °Cに保温した。 液面上 5 mmの高さ に格子間隔 3 ramのステア リ ン酸塗布テフロン 製の第 1段消泡層、 さ らに 3 mm上に上記格子と同仕様の 格子を直角方向に配置し第 2段消泡層と した。 槽底部に 配置したガラス製多孔質ノズル 4 から滅菌処理空気を平 均泡怪 1 . 5 mffl の泡径で、 通気速度 0 . 3 cmZsecで通気 して、 5 日間培養した。 この際の培養液の表面張力は 5 dynZcm2で培養液液滴と撥水材と の接蝕角は 8 5。 であ つた。 また上記通気での酸素移動速度は 7 m mo β e 02 / β · hであった。
    [0252] その結果、 細胞濃度は 4 . 2 X I 0 sケ πι β に達した この際に生成したアンモニアの濃度は 2 9 ppm 、 乳酸は 9 0 0 ppm であった。 溶存酸素濃度は培養期間中 2〜 5 PPm を維持した。 培養中に発生する気泡は 2段に設けた 消泡層 5で完全に消泡された。
    [0253] 実施例 1 7
    [0254] 下記組成の液体培地 1 5 0 & を 5 0 G' m fi坂ロフ ラ スコ 2 0本に分注した。
    [0255] 大豆抽出液 （大豆 1 0 0 g に水 9 0 0 πι β を添加し、 1 2 0 °C， 3 0分加熱抽出して濾過して得られる液）
    [0256] 9 8 7 g
    [0257] ぺプ 卜 ン 1 0 g
    [0258] り ん酸第 2 カ リ ウム 2 g 硫酸マ グネシ ウ ム · 7水和物 0 . 5 g
    [0259] 塩化カルシ ウ ム 0 . 5 g
    [0260] 塩化ナ ト リ ウム 0 . 5 g
    [0261] P H 7 . 0
    [0262] 各フ ラ スコ に寒天ゲル斜面培地入 り試験管で好気的に 静置培養したバチルス · ズブチ リ ス （枯草細胞） の菌体 を 1 . 1 X 1 06cells/ m J2 の濃度に接種し、 振幅 7 cm, 1 2 0 strokes で好気的に振盪培養した。 本培養液を前 培養液と し、 以下の本培養に用いた。
    [0263] 前記組成の液体培地 2 . 5 2 を内径 1 6 cm， 高さ 2 5 cmの培養槽 2 に入れ、 1 2 0 °C , 2 0分間スチーム滅菌 した。 培養槽と しては、 液面から 1 cm上部にジメチルポ リ シ 口 キサン （粘度 1 X 1 0 5 セ ンチボイ ズ） を塗布し た直径 1 6 cm , 厚さ 0 . 5 mm のステ ン レ ス製多孔扳 （孔 径 3 mm , 開口比 5 0 % ) を消泡層 5 と してな らびに槽底 部に リ ングスパージャ （孔径 1 nm， 孔数 1 2ケ） と貝型 撹拌翼を設けたものを用いた。
    [0264] 培養は下記の条件下で行った。
    [0265] 通 気 量 ： 0 . 2 m Zsec、 この と き の酸素移動速度は
    [0266] 1 0 m mo ώ e O z / ΰ. · hであった。
    [0267] 温 度 ： 3 5 0 °C
    [0268] P H : 7 . 0 に自動コ ン ト ロ ーノレ（中和剤 4NNa0n ) 撹拌坯度 ： 5 0 rpm 培養初期には少量しか発泡しないが培養 8時間以降で 多量の泡が発生した。 しかし、 発生する泡は消泡層 5 に よ リ容易に破砕し、 消泡層の上部に溢流する こ とはなか つた。
    [0269] 培養による増殖状態を第 3表に示した。
    [0270] 第 3
    [0271]
    [0272] 比較例 8
    [0273] 実施例 1 7 に用いた培養槽の消泡層 5 を敢リ はずした 以外は実施例 9 と同じ条件下で培養を開始した。
    [0274] しかし、 通気量 0 . 2 cm Z secで通気を開始し 8時間後 に液面上に泡が多量に発生し、 数秒後に培養槽排気口 2 4 よ り溢流扰態となつたため、 運転不能とな リ培養を 中止した。 .
    [0275] 比較例 9
    [0276] 実施例 1 7で用いた培養槽の消泡層を取り はずし気相 部に直径 5 c m， 輻 1 cmの消泡用翼をと りつけて 5 0 0 rp m で^転する以外は、 実施例 8 と同じ条件で培養を開 始した。
    [0277] しかし、 通気量 0 . 2 cm /secで通気を開始する と液面 上に泡が発生し、 数秒後に培養槽排気口 2 4 よ り溢流状 態となつたため、 運転不能とな り培養を中止した。
    [0278] 比較例 1 0
    [0279] 比較例 9 に於て、 通気量を回転消泡用翼による消泡効 果の限界通気量である 0 . 0 1 cm /secで通気しながら培 養した。 上記通気量での酸素移動速度は 0 . 0 2 m mo J2 e 〇 2 β · hであった。 培養中の溶存酸素濃度は電極法で 測定した結果、 O ppm であった。 培養による増殖状態を 第 4表に示した。
    [0280] 第 4 表
    [0281]
    [0282] 以上の様に従来公知の液面通気と回転翼によ る _機械的 消泡方法では液面に残る気泡が酵素の液中への溶解をさ またげるため、 菌の増殖が実施例 1 7 に比べ約 6分の 1 と低い。
    [0283] 実施例 1 8 2 β のガラス製培養槽 （直径 7 cm X高さ 5 2 cm) に下 記 1 Δ の液体培地を加え、 ク ロ レ ラ · ヒ レ ノイ ドザを 1 X 1 05cells/ m β の濃度に接種した。 培養槽側面に蛍 光-灯を設置し、 槽内壁面の照度を 5 X 1 03 ルク スと し た。 温度は外部ジャケッ トによ り 3 0 °Cに調節した。 培 養槽内の液面上 1 cmの位置にジメチルポリ シラン （粘度 7 X 1 05cPs) を含浸したポリ ブタ ジエン製の網 （孔形 ： 正方形 5 X 5 mm) を設置した。 さ らに槽底部にはリ ン ダスパージヤー （直径 5cm， 孔径 1 ， 孔数 8ケ） を設 置し、 炭酸ガスを 5 % ( V - V ) 富化した空気を 0 . 1 cm/ sec で通' し 7:
    [0284] 酵母ェキス 1 g
    [0285] 麦芽ェキス 1 ε
    [0286] 肝臓ェキス g
    [0287] ペプ ト ン 0 ， 3 g
    [0288] グリ コース 0 . 3 g
    [0289] デキス ト リ ン 2 g
    [0290] 硝酸カ リ ウム 2 g
    [0291] 硝酸マグネシウム ' 7水和物 0 .5 g
    [0292] リ ン酸第 1 カ リ ウム 0 ， 0 s
    [0293] 硝酸第 1鉄 0 . 0 0 5 g
    [0294] P H 7. 0
    [0295] 液面上には培養初期には少量しか発生せず消泡層で十 分破泡する こ と ができ る。 培養 5時間以降では液面上に 多量の泡が発生するが、 消泡層 5 によ り効果的に铍泡す る こ と ができ、 培養全期間中泡が消泡層を越えて溢流す る こ と はなかった。
    [0296] 培養による増殖状態を第 5表に示した。
    [0297] 第 5 表
    [0298]
    [0299] 比較例 1 1
    [0300] 実施例 1 8で用いた培養槽の消泡層を取り はずした以 外は実施例 1 8 と同じ条件下で培養を開始した。
    [0301] しかし、 通気量 0 . 1 c m Z s e cで通気を開始した。 培養 1 2時間目 までは液面上に発生した気泡が自然に破泡 し たが、 1 3時間 目 には培養槽の気相部分に泡が充満し、 培養槽上部の排気口 2 4 よ り溢流し、 排気口に接続 した無菌フィルタ が細胞によ り閉塞したため、 運転不能 とな り、 培養を中止した。 〔産業上の利用可能性〕
    [0302] 本発明によれば、 培養液を疎水性膜を用いて濾過する ことによ り、 流体の剪断力による細 ½の損傷や膜の目詰 り を招く ことなしに細胞を含まない培養濾液を抜き出す こ とができる。 これによ り 、 培養槽内の培養液交換を効 率よ く行う ことができ、 長期間安定して高濃度の細胞を 培養できるので、 イ ンシュリ ン等の製造に極めて有用で あ
    [0303] また、 従来困難とされてきた消泡を効果的に行う こ と ができるので、 液中通気方式による酸素供給が可能とな リ、 酸素の高効率活用ができるため、 従来の液面通気方 式に比べ酸素の消費量を 1 Z 1 0〜 1 Ζ 5 0 に低減でき る。 さ らに発泡性の高い血清等を用いた培養液に対して も 5倍以上の酸素を供給する ことができ、 培養効率を高 めること ができるので、 量産化に有効である。
    权利要求:
    Claims

    請求の範囲
    . 生物の細胞を液俸培養しながら培養液の一部を濾過 膜を用いて瀘過して取 り 出 し、 新しい培養液を補給す る細胞培養方法において、 上記濾過膜が疎水性濾過膜 であ り、 該瀘過膜は間欠的に培養液で逆洗する こ と を 特徴とする細胞培養方法。
    . 生物の細胞を液体培養しながら培養液の一部を濾過 膜を用いて濾過して取 り 出 し、 新し い培養液を補給す る細胞培養方法において、 上記濾過膜が琼水性濾過膜 の表面に親水性濾過助材層を有するプレ コ ー ト膜であ リ 、 該濾過膜は間欠的に培養液で逆洗する こ と を特徴 とする細胞培養方法。
    . 請求項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜が 1 本以 上の中空糸膜である こ と を特徴とする細胞培養方法。 . 請求項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜が培養液 の液滴との接触角が 8 0度以上の素材で形成されてい る こ と を特徴とする細胞培養方法。
    . 請求項 1 または 2 において、 疎水性瀘過膜の瀘過孔 を培養液で充塡 してか _ら濾過を行う こ と を特徵とする 細胞培養方法。
    . 請求項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜の限界圧 以上で逆洗する こ と を特徴とする細胞培養方法。
    . 請求項 ： I または 2 において、 辣水性濾過膜を逆洗す る培養液が、 濾過した培養液から老廃成分を除去した 培養液であるこ と を特徵とする細胞培養方法。
    . 請求項 1 または 2において、 濾過し.た培養液中の老 廃成分を老廃成分除去手段によ り除去し、 該老廃成分 除去液を疎水性濾過膜の逆洗用液の一部または全部と して用いる こと を特徴とする細胞培養方法。
    . 請求項 8 において、 老廃成分除去手段が拡散透析法、 限并瀘過法または精密濾過法であること を特徵とする 細胞培養方法。 ―
    . 請求項 1 または 2 において、 培養液中に撹拌翼を設 け、 該撹拌翼の回転面の周囲に琼水性濾過膜を設けた こと を特徴とする細胞培養方法。
    . 請求項 1 または 2 において、 培養によ り生成する培 養液の泡沫を、 培養液面上に配置した撥水性消泡層と 接触させるこ とによ り、 該泡沬を破泡しながら培養を 行う こと を特徵とする細胞培養方法。
    . 請求項 1 1 において、 該消泡層の表面が、 培養液の 液滴との接触角が 3 0度以上の撥水性を有する こと を 特徵とする細胞培養方法。
    . 請求項 1 1 において、 少な く とも消泡層表面に形成 された撥水性材料が有機けい素高分子であることを特 徴とする細胞培養方法。
    . 請求項 1 1 において、 消泡層が多孔性であ り、 その 開口比が 5 0 %以上である こ と を特徴とする細胞培養 方法。
    15 . 請求項 1 1 において、 消泡層が多孔性であ り 、 その 孔の大き さ が 2 〜 5 0 mmである こ と を特徵とする細胞 培養方法。
    1 6 . 請求項 1 0 において、 消泡層が、 粘度が 1 X 1 0 4 センチボイ ズ以上の撥水剤を基材に塗布または含浸さ れたものである こ と を特徵とする細胞培養方法。
    1 7 . 請求項 2 において、 親水性濾過助材が細胞の沈降速 度よ リ大なる沈降速度を有する こ と を特徵とする細胞 培養方法。
    1 8 . 請求項 2 において、 濾過膜を収納する濾過器を培養 槽と配管で連結して培養槽の外部に設け、 疎水性濾過 膜を濾過器内の上部に配置し、 密度が培養液の密度よ リ も小さ い親水性濾過助材を用いる こ と を特徴とする 細胞培養方法。
    1 9 . 培養細胞に対する有用ガスの供給手段、 培養液の供 給手段、 老廃培養液の排出手段を有する生物細胞の液 体培養装置において、 上記老廃培養液の排出手段が疎 水性滤過膜からなる培養液濾過手段を介 して設け られ、 かつ、 該疎水性瀘過膜が培養液によ り 逆洗でき る手段 を有する生物細胞の液体培養装置。
    20 . 培養細胞に対する有用ガスの供給手段、 培養液の供 給手段、 老廃培養液の排出手段を有する生物細胞の液 体培養装置において、 上記老廃培養液の排出手段が疎 水性瀘過膜からなる培養液濾過手段を介して設けられ、 該疎水性濾過膜が培養液によ り逆洗できる手段を備え、 かつ、 培養液表面上に消泡手段を有する生物細胞の液 体培養装置。
    . 請求項 1 9 または 2 0 において、 培養液濾過手段が 疎水性中空糸膜の表面に親水性'瀘過助材層を有するプ レコー ト膜から成るこ と を特徵とする生物細胞の液体 . 疎水性中空糸膜の雨端に、 外径が中空糸膜の内径よ リ大で、 その先端部において中空糸膜に揷入可能な外 怪を有するよう に勾配を持たせて成形され、 かつ、 該 中空糸膜の離脱防止のための突起部分が設けられた膜 拡張部材が揷入されており、 該揷入部が接続部に固定 され、 該接続部を介して配管と連結し得るよう にした こ と を特徵とする生物細胞分離用濾過器。
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